환삼덩굴 (Humulus japonicus) 시료는 전남 장흥 지역에서 자생하는 것을 지상부 기준 600 g을 채집하여 사용하였다. 시료는 균일하게 혼합 및 분배하여 25℃의 상온에서 7 일간 음건한 것 (25-7D)과 50℃의 건조기에서 12 시간 동안 가열 건조한 것 (50-12H)으로 구분하였다. Luteolin, luteolin 7-O-glucoside, luteolin 4’-O-glucoside 표준품은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입한 것을 사용하였다.

조건별로 건조된 환삼덩굴 시료는 동일한 입자 크기로 분쇄를 실시하였으며, 분쇄된 각 시료 5 g에 메탄올 100 ㎖를 혼합하여 분당 180 회의 속도를 적용한 진탕추출을 24 시간 동안 실시하였다. 건조 조건별로 3회 실시된 추출액의 상등액 일정량을 0.45 ㎛ syringe filter (Whatman, Maidstone, England) 로 여과를 실시한 후 4℃ 이하로 냉장 보관하면서 분석에 사용하였다.

환삼덩굴 추출물의 성분 분석을 위해 Gemini NX-C18 (4.6 ㎜ × 150 ㎜, 3 ㎛, Phenomenex, Torrance, CA, USA) column을 장착한 LC-30A (Shimadzu, Kyoto, Japan) 액체크로마토그래피 (liquid chromatograph; LC) 시스템을 사용하였다.

시료 주입량은 5 ㎕, column oven은 40℃를 유지하였으며, 이동상으로 0.1% formic acid (A)와 acetonitrile (B)을 사용하여 유속은 0.6 ㎖/min으로 유지하였다. 이동상은 초기 5 분까지 20% B, 5 분에서 22 분까지 20% B에서 65% B가 되도록 하였고, 이후 26 분까지 65% B에서 100% B가 되도록 하였으며, 32 분까지 100% B를 유지한 후 다시 20% B로 낮춰서 40 분간 측정 및 분석을 실시하였다.

주요 peak의 UV spectra는 215 ㎚ − 400 ㎚ 범위에 측정하였으며, 정량분석을 위한 검출기 (SPD-10Avp, Shimadzu, Kyoto, Japan) 파장은 350 ㎚로 설정하였다. 정량분석을 위한 luteolin 표준품 용액은 2.0 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖, 0.02 ㎎/㎖ 농도로 조제하였으며, luteolin 7-O-glucoside와 luteolin 4’-O-glucoside 표준품 용액은 1.0 ㎎/㎖, 0.25 ㎎/㎖, 0.05 ㎎/㎖, 0.01 ㎎/㎖ 농도로 조제하여 분석에 사용하였다.

건조 방법에 따른 주요 변화 성분 peak에 대한 질량분석은 LC-30A (Shimadzu, Kyoto, Japan) 액체크로마토그래피와 연동된 LCMS-8050 (Shimadzu, Kyoto, Japan) 질량분석기 (mass spectrometer; MS)를 사용하였으며, LC 분석 조건과 동일한 분리 조건을 적용하였다.

MS 분석을 위한 interface와 desolvation line, 그리고 heat block 온도는 각각 300℃, 250℃, 350℃로 설정하였으며, nebulizing gas, drying gas, heating gas는 각각 3 ℓ/min, 9 ℓ/min, 9 ℓ/min으로 공급하였다. MS² 분석을 위한 collision-induced dissociation gas인 argon은 270 kPa의 압력으로 공급하였으며, positive와 negative mode에서 100 m/z - 1,000 m/z의 범위의 MS scan 분석을 실시한 후 확인된 모분자량을 적용하여 추가로 MS² 분석을 실시하였다.

약용 식물의 경우 건조를 통해 수분 함량을 낮춤으로써 저장기간 동안 성분 변화나 변질을 줄일 수 있으며, 이로 인해 저장 기간을 연장시키는 데 필수적인 과정으로 활용되고 있다. 또한 건조를 통해 식물 원료의 분쇄를 쉽게 하며, 추출 과정에서 수율을 증진시키는 등의 효과를 얻을 수 있다 (Choi et al., 2016; Hur et al., 2018; Choi et al., 2022).

약용 식물의 건조 방법으로서 기본적인 상온건조와 함께 열풍건조 등 가열건조 방법이 상업적으로 가장 빈번하게 이용되고 있으며, 연구 목적이나 고가의 원료의 건조에 진공건조나 동결건조 방법이 사용되고 있다 (Lee. 2018; Youn et al., 2019; Yun and Kang, 2021).

국내에서의 상온건조는 계절이나 환경적인 영향에 따라 편차가 있을 수는 있지만 25℃ 내외의 온도로 원료의 수분이 목적하는 수준까지 도달시키는 단순한 과정으로 이루어지며, 건조 공간의 상대습도나 기류의 영향을 받게 된다.

건조 대상의 크기나 모양, 성분 등에 따라 건조에 필요한 시간이 다양하지만 환삼덩굴과 같은 경우 3 일 − 5 일 수준의 건조 시간이 소요된다. 반면, 통상 40℃ 이상의 고온을 사용하는 가열건조는 상온 건조에 비해 건조시간이 짧으며, 열풍건조와 같이 부가적인 기류를 사용하는 가열건조 방법은 건조 시간을 더욱 단축시킬 수 있다.

상온건조와 마찬가지로 건조 대상 원료 특성에 따라 다르지만 환삼덩굴을 기준으로 50℃ 열풍건조 방법을 적용하면 8 시간 − 12 시간 수준의 건조 시간이 소요된다. 건조 시간을 단축시키기 위해 가열 온도를 높일 수 있지만 온도에 민감한 성분의 변화가 나타날 수 있으므로 일반적인 가열 건조는 60℃ 이하의 조건이 우선적으로 검토되고 있다 (Eom et al., 2009; Kim et al., 2013; Jeong et al., 2015).

50℃의 열풍으로 12 시간 건조한 환삼덩굴 시료 (50-12H)와 25℃의 상온에서 7 일간 건조한 시료 (25-7D)의 메탄올 추출물의 자외선 (ultraviolet; UV) 검출기를 적용한 액체크로마토그래프 (liquid chromatogrraph; LC) 분석을 실시한 결과, Fig. 1과 같이 머무름 시간 9.64 분, 11.86 분, 16.12 분에 나타난 peak a, b, c의 변화가 확인되었다.

Fig. 1.  LC chromatograms of Humulus japonicus extract by drying method.

(A) Chromatogram of extracts using hot air drying method (50℃, 12 hours), (B) Chromatogram of extracts using room temperature drying method (25℃, 7 days). Different superscripts are major peaks.

구체적으로는 50-12H 추출물에서는 peak a와 b가 특징적으로 큰 peak 면적을 나타냈으며, peak c는 현저히 적은 peak 면적을 나타냈다. 25-7D 추출물에서 peak a와 b의 peak 면적은 급격히 적어졌으며, peak c의 면적은 반대로 커진 것을 확인할 수 있었다.

확인된 주요 peak의 성분 특성 관련 정보를 추가로 확보하기 위하여 각 peak의 UV spectrum 측정하였으며, Fig. 2와 같은 결과를 확인할 수 있었다.

Fig. 2.  UV spectra of major peaks of H. japonicus extract.

(A) UV spectrum of peak a, (B) UV spectrum of peak b, (C) UV spectrum of peak c.

Peak a, b, c에 해당하는 성분에 대한 정성 분석과 함께 건조 방법에 따른 성분 변화의 유형을 검토하기 위해서 LC 분석과 동일한 분리 조건을 적용한 질량분석기 (mass spectrometer; MS) 분석을 실시하였다.

Scan mode의 MS 분석 결과를 제시한 Fig. 3과 Fig. 4에서 peak a와 b는 positive mode와 negative mode에서 각각 [M+H]⁺와 [M-H]^-의 형태인 449.1 m/z와 447.1 m/z가 확인되었으며, positive mode에서는 추가로 [M+Na]⁺ 형태인 471.1 m/z가 나타났다. Peak a와 b의 MS² 분석에서는 positive mode와 negative mode에서 각각 287 m/z와 285 m/z가 특징적으로 나타났으며, 나머지 조각 ion들의 패턴에서도 유사한 부분이 확인되었다.

Fig. 3.  LC-MS analysis results of the major peak a.

(A) positive mode MS spectra of the major peak a, (B) negative mode MS spectra of the major peak a, (C) positive mode MS² spectra of 449.1 m/z ([M+H]⁺), (D) negative mode MS² spectra of 447.1 m/z ([M-H]^-).

Fig. 4.  LC-MS analysis results of the major peak b.

(A) positive mode MS spectra of the major peak b, (B) negative mode MS spectra of the major peak b, (C) positive mode MS² spectra of 449.1 m/z ([M+H]⁺), (D) negative mode MS² spectra of 447.1 m/z ([M-H]^-).

Fig. 5에 제시한 peak c의 MS 분석 결과에서 positive mode와 negative mode에서 각각 [M+H]⁺와 [M-H]^-의 형태인 287.1 m/z와 285.1 m/z가 확인됨에 따라 분자량이 286인 성분으로 추정할 수 있었다. MS² 분석에서는 positive mode에서 153 m/z, 135 m/z, 171 m/z 등의 조각 ion들이 확인되었다. Negative mode에서는 133 m/z가 강하게 나타났으며, 175 m/z, 151 m/z 등의 조각 ion이 확인되었다. 이와 같은 MS 및 MS² 분석 결과는 기존 문헌 검토를 통해 luteolin 성분에서 나타나는 형태임을 알 수 있었다 (Shin et al., 2018; Xu et al., 2022). 또한 Fig. 2에 제시한 peak c의 UV spectrum에서도 기존의 연구보고들에서 제시하고 있는 luteolin의 UV spectrum과 동일 또는 유사함을 확인하였다 (Lech et al., 2014; Iwashina et al., 2020).

Fig. 5.  LC-MS analysis results of the major peak c.

(A) positive mode MS spectra of the major peak c, (B) negative mode MS spectra of the major peak c, (C) positive mode MS² spectra of 287.1 m/z ([M+H]⁺), (D) negative mode MS² spectra of 285.1 m/z ([M-H]^-).

한편, peak a와 b의 MS² 분석에서 positive mode의 287 m/z와 negative mode의 285 m/z가 공통적으로 확인된 결과는 peak c 성분으로 검토되는 분자량 286의 luteolin 구조가 peak a와 b 성분에 포함되었다는 판단을 가능케 하였다.

결과적으로 peak a, b는 분자량 448을 가지며, luteolin을 aglycone으로 포함하는 성분이므로 glucose와 같은 hexose를 포함하는 것으로 추정이 가능하였다. 관련된 문헌 검토를 통해 Fig. 2에 제시한 것과 같은 UV spectrum을 나타내는 성분으로서 luteolin 7-O-glucoside와 luteolin 4’-O-glucoside로 확인하고 표준품을 확보하여 대조 분석을 실시하였다 (Yuan et al., 2018; Iwashina et al., 2020).

LC 및 LC-MS 분석 결과를 바탕으로 실시한 표준품 대조 분석 결과에서 peak a, b, c가 Fig. 6에 제시한 것과 같이 각각 luteolin 7-O-glucoside, luteolin 4’-O-glucoside, luteolin임을 확인하였다.

Fig. 6.  Chemical structures of major compounds (A) and LC chromatogram of standard solution (B).

Luteolin은 환삼덩굴을 포함한 다양한 식물에서 발견되는 flavone 구조의 성분으로서 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Sung et al., 2015; Xu et al., 2022). 대표적인 활성으로서 항산화와 다양한 항염증 관련 효과가 있으며 (Sung et al., 2015; Wang et al., 2022a; Xu et al., 2022; Kim et al., 2023b), 고요산혈증과 통풍성 관절염 치료 효과나 Parkinson 질환 관련 활성도 나타내는 것으로 보고되고 있다 (Lin et al., 2018; Lee et al., 2019).

Luteolin 7-O-glucoside는 cynaroside나 luteoloside로 불리기도 하는 성분으로서 환삼덩굴뿐만이 아니라 다양한 식물에서 발견되고 있으며 (Xu et al., 2022; Ryu and Ma, 2023), luteolin과 같이 항산화 활성이나 Parkinson 질환 관련 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Sung et al., 2015; Lee et al., 2019). 또한 피부의 광노화 억제 효과나 알콜로 인한 간 손상을 예방하는 효과에 대한 보고도 있었다 (Nam et al., 2020; Cho et al., 2023).

Luteolin 4’-O-glucoside는 떡쑥 (Gnaphalium affine)이나 매듭풀 (Kummerowia striata) 등의 식물에 존재하는 것으로 보고되는 luteolin 배당체로서 항산화 활성과 함께 interleukin (IL)-5 억제를 통한 알레르기 염증 억제 효과와 통풍성 관절염 관련 치료 효과 등이 있는 것으로 보고되고 있다 (Park et al., 1999; Lin et al., 2018; Xu et al., 2022).

각 표준품의 농도별 용액을 조제하여 환삼덩굴 추출물 분석조건과 동일한 조건에서 분석을 실시한 후 작성한 검량선 정보를 Table 1에 제시하였다. 정량분석 결과의 정확성을 위하여 농도별 표준품 용액 분석을 추출물 시료들의 분석 이전과 이후에 2회 측정하여 평균값을 적용하는 협차 검량법 (bracket calibration)을 적용하였으며, 분석이 실시된 농도 범위에서 세 가지 성분 모두 우수한 직선성을 나타내었다. 또한 Fig. 6(B) 에 제시한 것과 같이 각 성분간 간섭 현상도 나타나지 않아 세 가지 성분의 동시 분석에도 문제가 없음을 확인하였다.

Table 2에 제시한 건조 방법별 환삼덩굴 추출물에 대한 정량 분석 결과에서 상대적으로 고온에서 단시간 건조를 실시한 50-12H 추출물에서는 luteolin 7-O-glucoside, luteolin 4’-O-glucoside의 함량이 각각 0.480 ㎎/㎖와 0.318 ㎎/㎖로 나타났으며, luteolin 함량은 0.030 ㎎/㎖ 수준으로 확인되었다. 반면, 상온에서 장시간 건조를 실시한 25-7D 추출물에서는 luteolin 7-O-glucoside, luteolin 4’-O-glucoside의 함량이 각각 0.058 ㎎/㎖와 0.043 ㎎/㎖로 50-12H보다 낮게 나타났으며, luteolin 함량은 0.663 ㎎/㎖로 50-12H보다 높게 나타났다.

한편, 추출에 사용된 건조 환삼덩굴 시료량 (5 g)과 추출용 매의 부피 (100 ㎖)를 감안하면 50-12H 건조 시료 중의 luteolin 7-O-glucoside와 luteolin 4’-O-glucoside의 함량이 각각 9.60 ㎎/g, 6.36 ㎎/g 수준이며, 25-7D 건조 시료 중의 luteolin 함량 수준이 13.26 ㎎/g임을 알 수 있었다.

본 연구에서 확인된 환삼덩굴의 주요 성분 중 peak a와 peak b에 해당하는 luteolin 7-O-glucoside와 luteolin 4’-O-glucoside는 Fig. 6(A)에 나타낸 바와 같이 구조적으로 β-glucosidase와 같은 가수분해 효소의 작용으로 peak c의 luteolin과 glucose로 분해될 수 있다. 환삼덩굴과 같은 식물소재는 채취나 수확 이후에도 일정 시간 동안 생명 현상이 지속되며, 이러한 생명 현상의 하나로 자체 효소 작용으로 인한 성분이나 색상 등의 변화가 나타난다. 이러한 변화 자체가 바람직한 경우도 있지만, 반대로 억제되어야 할 경우도 있는데, 산업화 및 품질관리 측면에서는 목적하는 방향으로 일정하게 관리할 필요가 있다.

자체 효소의 작용에 영향을 미치는 다양한 요인 중에서 특히 온도와 수분 이 중요한 것으로 알려져 있으며, 특히 가수분해 (hydrolysis)와 관련된 경우에는 수분 함량이 결정적인 영향을 주기도 한다. 효소에 의한 flavonoid glycoside의 분해 및 전환은 다양한 식물 소재에서 다뤄지고 있으며, 대부분은 가수분해의 과정을 거치는 것으로 보고되고 있다 (Slámová et al., 2018; Yuan et al., 2018; Hwang et al., 2023).

국내에서도 flavonoid 성분 함량이 높은 것으로 알려진 감귤류 유래의 소재를 중심으로 효소 작용으로 나타나는 flavonoid 배당체와 비배당체의 함량 변화에 대한 연구가 있었으며, 본 연구의 결과와 같이 가수분해 효소 작용에 의한 flavonoid 비배당체 함량이 증가되는 것으로 보고하고 있다 (Ahn et al., 2005; Park et al., 2019a; Shin et al., 2020).

따라서 식물 소재가 가지고 있는 자체 효소에 의한 가수분해를 제어하기 위해서는 건조 과정에서의 건조 속도와 같은 수분 변화 양상을 검토할 필요가 있다. Table 2의 결과와 병행하여 검토하면 상온에서 상대적 느린 건조 속도로 건조 과정이 수행되면 환삼덩굴 자체에 포함된 가수분해 효소의 작용 가능 시간이 그만큼 증가하게 되며, 이로 인해 luteolin 배당체가 분해되어 luteolin으로 전환되는 비율이 증가되는 것으로 판단할 수 있다.

한편, 효소의 작용에는 온도 역시 중요한 요인이며, 가열 수준에 따라 수분 함량과 관계없이 효소의 비활성화가 성분변화에 영향을 나타낼 수 있으므로 본 연구를 통해 확인된 기본적인 건조 방법에 따른 성분 변화 차이 외에도 가열 온도나 시간 등 보다 다양한 변수들을 적용한 추가적인 연구가 환삼덩굴의 산업적 이용을 위해서 이루어질 필요가 있을 것이다.