작약속 (Paeonia spp.)은 미나리아재비과 (Ranunculaceae)에 속하며 세계적으로 25 - 40 여 종이 존재하는 것으로 알려져 있다. 국내에는 모란 (P. suffruticosa), 백작약 (P. japonica), 산작약 (P. ovobata), 작약 (P. lactiflora) 등이 자생하며 주요 재배종은 모란과 작약이다 (Stern, 1943). 영어권에서는 모란과 작약을 각각 tree peony와 peony라고 부르는데 꽃이 크고 아름다우며 꽃잎이 풍성하고 색이 다양하다는 공통점이 있다. 모란은 낙엽 관목으로 키가 2 m까지 자라고 작약은 여러해살이풀로 50 ㎝에서 90 ㎝까지 성장한다 (Lee, 2006).

모란과 작약의 지하부는 예로부터 한국, 중국, 일본 등 동아시아에서 심혈관 질환 등에 많이 쓰여왔으며, 대한민국 약전 (Korean Pharmacopoeia, KP)에 따르면 모란은 목단피로 불리는 뿌리껍질을 약으로 사용하고 작약은 뿌리 부위를 사용한다. 목단피는 진정제, 항염증제 및 다양한 여성 장애 치료제에 쓰이고 작약은 진통제 및 해열제로 사용된다 (WHO, 1999).

모란의 꽃에는 지표성분인 paeoniflorin 함량이 모란의 뿌리보다 높게 함유되어 있고 많은 종류의 flavonoid, monoterpenoid, 항산화 성분이 함유되어 있다 (Chen et al., 2003; Li et al., 2009; Han and Bhat, 2014; Wang et al., 2017, Yun et al., 2018). Yun 등 (2018)은 모란의 뿌리, 잎, 꽃에서 추출 용매별 유효성분의 함량 변화를 비교하였으며, Jung 등 (2010)은 작약꽃을 대상으로하여 polyphenol의 종류와 함량을 동정하고 지표성분인 paeoniflorin이 뿌리, 잎, 줄기 뿐만 아니라 꽃에서도 검출되는 사실을 확인하였다.

같은 Paeonia 속에 속해 있는 모란과 작약은 건강기능식품 및 기능성화장품 등으로 활용 가치가 높지만 꽃의 생김새가 비슷하고 주로 가공되어 운반되기 때문에 원산지 표기 문제나 종 혼용의 문제가 있다 (Moon et al., 2013). 대부분의 식물 분류 및 종에 대한 판별은 형태학적 특성에 따른 차이에 의존하고 있어 유사한 형태의 식물 종 사이에서의 구분에는 제한적이다.

형태적 특성을 이용한 구별의 한계를 해결하기 위해 식물분류 및 종 판별 기술인 분자 마커가 제시되고 있는 바, Kim 등 (2014)은 백수오 (은조롱)와 하수오의 식물분류학적 위치와 유효성분이 다름에도 하수오라는 이름으로 혼용되는 상황을 극복하고, 백수오와 이엽우피소의 성숙기 열매와 종자가 박주가리의 것과 비슷하여 나타나는 혼동을 해결하기 위해서 국내에서 재배되는 백수오, 이엽우피소, 박주가리 및 하수오의 형태적 형질을 비교한 바 있다. 또한 Kim 등 (2015)은 백수오의 뿌리와 이엽우피소의 뿌리가 육안상 식별이 불가능한 점을 극복하기 위하여 하수오, 백수오 및 이엽우피소의 종 판별이 가능하도록 psbA-trnH 유전자를 대상으로 종 특이적 마커를 개발하기도 하였다.

분자 마커는 분자 수준에서 개체들을 구별할 수 있는 마커시스템이며 random amplified polymorphic DNA (RAPD), inter-simple sequence repeat (ISSR), amplified fragment length polymorphism (AFLP), simple sequence repeat (SSR) 등이 널리 사용된다 (Huh, 2015). 또한 DNA 염기 서열 한 부위의 변이를 이용한 single nucleotied polymorphism (SNP)과 insertion (삽입) 또는 deletion (결실)된 부위를 이용하는 InDel을 대상으로 primer에 형광을 붙여 염기 서열간 차이를 실시간 분석하는 kompetitive allele specific PCR (KASP)과 high reslution melting (HRM)이 사용되기도 한다.

Bang 등 (2004)은 RAPD-SCAR 마커로 백출의 기원식물인 Atractylodes japonica와 A. macrocephala을 구별할 수 있음을 제시하였고 Sim 등 (2019)은 SNP 기반 HRM 마커를 개발해 Sanguisorba officinalis (오이풀), S. longifolia (긴오이풀), S. tenuifolia (흰오이풀)을 종 판별에 사용하였다.

현재까지 모란과 작약의 구분을 위해 작약 품종 구분을 위한 AFLP 마커와 SSR 마커 개발, 기원 판별 및 유연관계 분석이 이루어졌으나 (Wan et al., 2018; Xu et al., 2018; Wu et al., 2021) InDel 마커는 개발된 바 없다.

친자 확인 및 범죄현장의 용의자 추적에 주로 사용되는 Short Tandem Repeat (STR)과 DNA 염기 서열 한 부위의 변이를 이용한 SNP는 분석 시 고가의 장비가 필요하기 때문에 DNA 샘플 분석에 어려움이 있다 (Jobling and Gill, 2004; Kim et al., 2012; Schneider, 2012; Li et al., 2014). 이에 반해 InDel은 PCR 기반의 공우성 마커로서 앰플리콘의 길이 차이를 이용하여 agarose gel을 이용하여 실험실 수준에서 샘플을 쉽게 구별할 수 있다 (Pǎcurar et al., 2012). InDel은 SNP와 동일하게 식물을 포함한 다양한 종에서 게놈 전체에 걸쳐 매우 풍부하게 분포되어 있다 (Rafalski, 2002; Riahi et al., 2013). 또한 돌연변이율이 낮고 스터터 피크가 없으며, 지리적으로 멀리 떨어져 있는 모집단 사이의 대립유전자 빈도에서도 유의미한 차이를 나타내므로 ancestry informative marker (조상 정보 표지자)로 사용된다 (Pereira et al., 2009; Santos et al., 2015; Cortellini et al., 2020).

본 연구에서는 선행연구에서 완성된 총 길이 152,811 bp의 모란의 엽록체 유전체 (Park et al., 2019)와 총 길이 152,811 bp의 작약 엽록체 유전체 (Lee et al., 2019) 정보를 비교하고 형태적 특성으로 구분이 어려운 두 종의 구분을 위하여 InDel 마커를 개발하였다. 또한 개발된 마커가 모란과 작약의 다양한 개체에 적용되는지, 저농도의 DNA에도 구별 가능한지, 혼합 여부도 판단 가능한지 확인하고자 하였다.

최근 합성 화합물의 독성과 부작용 사례가 증가함에 따라, 오랫동안 이용해오며 안전성이 확인된 천연자원에 대한 인기가 증가하고 있다 (Jo, 2012). 천연자원을 이용해 만든 건강기능식품 및 기능성화장품은 안전하면서도 복합적인 기능을 기대할 수 있는데 천연물 시장이 전 세계적으로 꾸준히 성장하고 있는 상황에서 원료로 사용될 천연물 소재 탐색 및 기능성 연구, 안전성 연구가 활발히 이루어지고 있다 (Cho et al., 2011; Lee et al., 2020).

모란과 작약에는 약효성분인 paeoniflorin이 함유되어있기 때문에 항염과 진통에 효과가 있어 통풍이나 관절염 치료 등에 이용되어왔다. 모란과 작약은 꽃의 형태가 비슷할 뿐 아니라 약재 시장과 화장품 원료시장 등에서 가공된 상태로 거래되기 때문에 형태학적 특성에 의존하여 구분하는 데는 한계가 있다 (Park and Kim, 2009). 본 연구를 통해 개발된 PsPl-InDel-12은 국내에서 재배중인 모란 19 개체에서는 388 bp, 작약 6 개체에서는 280 bp의 앰플리콘이 증폭되어 명확히 구분할 수 있었다. 국내외 재배 모란과 작약에 대해 분자 수준의 종 구분에 활용할 수 있을 것이라 기대된다. 또한 PsPl-InDel-12은 InDel 마커로써 SNP 마커에 비해 최소한의 실험장비로 크기에 따라 쉽게 구별할 수 있어 활용 가치가 높을 것으로 사료된다.

그러나 genotyping에 사용된 작약 개체 수가 적고, 수집 자원이 국내 재배종에 국한되어 있기 때문에 실제 유통 시장에서 적용되기 위해서는 산작약 등 국내 희귀종을 포함한 국내 외 Paeonia속 모란과 작약 종, 교배종 및 다양한 Paeonia속 원예용 재배 도입종 등에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

혼합 DNA의 분석은 법과학과 식품과학에서 주로 다뤄지고 있으며, 식물보다 동물에서의 연구가 활발하다 (Montiel-Sosa et al., 2000; Park et al., 2007; Lee et al., 2014; Eom et al., 2018). Lee 등 (2017)은 돼지고기 위주로 제조된 소시지에 저가 원료인 닭고기의 혼합 여부를 판별하기 위해, 종 특이적 DNA 염기서열 차이를 이용한 real-time PCR로 돼지와 닭 DNA의 검출 한계가 각각 0.05 ng 이상임을 확인하고, DNA 혼합비가 5 : 5, 7 : 3, 9 : 1인 경우에도 정량분석 가능함을 확인하였다.

또한, Ujihara 등 (2005)은 단일 품종으로 구성되지 않고 혼합되어 판매되는 시중의 녹차를 구매하여, 제품 라벨지에 표기된 대로 Yabukita와 Meiryoku 품종이 실제 혼합되어 있음을 cleaved amplfied polymorphic sequence (CAPS) 마커로 확인하고, DNA 혼합비가 5 : 1과 9 : 1인 경우에도 정량분석이 가능함을 확인하였다.

본 연구에서는 10 pgㆍ㎕^-1의 농도까지도 모란과 작약의 밴드가 뚜렷하게 나타나고 혼합비가 7 : 3인 모란과 작약의 DNA에서도 두 밴드가 증폭되어 육안으로 확인 가능하였다. 특히 10 pgㆍ㎕^-1의 농도에서 작약에 비해 모란의 밴드가 더욱 선명했으며, 모란과 작약의 혼합 여부 판단 시 모란은 9 개의 혼합 DNA에서 밴드가 모두 나타났다. 따라서 PsPl-InDel-12는 모란의 판별에 더욱 유용할 것이라 판단된다.

소비자들의 신뢰 확보를 위한 과학적 판별 기술, 검증법이 필요한 시점에서 PsPl-InDel-12는 국내 모란과 작약의 잎과 꽃을 이용한 분석에서 종의 판별이 가능하였다. 또한, 모란과 작약의 원료 품질을 보증하고 소비자들의 원료에 대한 신뢰도 향상을 위해서, 향후 모란과 작약의 가공 제품에 대해 PsPl-InDel-12이 적용되는지 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.