인삼 종자의 겉 표면을 살균하기 위해서 70% ethanol에 2분 침지 후 멸균수로 헹구고 0.5% NaOCl에 15분 침지시키 는 것을 5회 반복하여 멸균하였다. 분쇄기에 0.5% NaOCl을 넣고 30분 이상 방치한 후 멸균수로 5회 세척하여 멸균한 분 쇄기에 멸균된 종자의 종피를 제거하고 멸균수와 함께 넣고 1분간 분쇄했다. 분쇄가 끝난 시료를 튜브로 옮기고 종자 파 편들이 가라앉을 때까지 약 20분 기다린 후 상등액 500µl를 1/10 TSA (Tryptic Soy Agar) 배지에 유리막대로 도말하였다. 도말 후 37°C에서 48시간 배양하였다. 배양된 내생균들은 자 란 형태와 색깔로 구분하여 계대배양 하여 분리하였다.

분리된 96개의 콜로니에서 SolGent purification system (Daejeon, Korea)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 16s rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통해 미생물 동정을 실시하였다. 시 퀀싱 반응은 Applied Biosystems (Foster City, California, USA)의 BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits을 이용하여 진행하였다. BIO-RAD (Hercules, CA, USA)의 DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler 로 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'), 1492R(5'-TACG GYTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 이용하여 PCR 분 석한 뒤 inter-primer인 518F (5'-CCAGCAGCCGCGGTA ATAC G-3')와 800R (5'-TACCAGGGTATCTAAT CC-3')을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 반응이 끝나면 반응에 참여 하지 않은 dNTP와 반응물을 제거한 후, ABI 3730xl DNA Analyzer에 로딩하여 시퀀싱 결과를 얻었다. 얻어진 16s rRNA 유전자 염기서열을 NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)의 BLAST program (program: BLASTN 2.2.29, database name: rRNA_ typestrains/prokaryotic_16S_ribosomal_RNA) 을 이용하여 유사 한 염기서열을 검색하였고 CLUSTAL_X software (Thompson et al., 1997)를 활용하여 유연관계를 분석하였다. Phylogenetic tree분석은 neighbor-joining method (Saitou and Nei, 1987)를 사용하였다.

개갑처리 완료된 인삼종자에서 내생균을 분리하기 위해 표면 살균된 종자를 분쇄하고 멸균수에 침지한 후 상등액을 배지에 배양한 결과 Fig. 1과 같은 인삼종자내생균을 확인하였다.

균동정을 위해 배지의 단일콜로니 96개를 계대 배양하여 16s rDNA 염기서열을 분석한 결과 8개의 종으로 분류할 수 있었다. 분리된 인삼종자내생균을 각각 PgSEB5-37A, PgSEB5- 37B, PgSEB5-37C, PgSEB5-37D, PgSEB5-37F, PgSEB5- 37G, PgSEB5-37H 라고 명명하였다. 그 염기서열을 BLASTN program을 이용하여 분석한 결과에 따르면 PgSEB5-37A는 Caulobacter sp.. PgSEB5-37B와 PgSEB5-37H는 장내세균과 (Enterobacteriaceae)에 속하는 Enterobacter sp., PgSEB5-37C 는 Chryseobacterium sp., PgSEB5-37D는 Sphingomonas sp., PgSEB5-37E는 Pseudomonas aeruginosa, PgSEB5-37F는 Duganella violaceusniger, PgSEB5-37G는 Duganella sp.로 동정되었고, 분리된 인삼내생균 모두 각각의 미생물들과 상 동성이 97% 이상인 것으로 확인되었다 (Table 1).

그리고 인삼종자내생균에서 분석된 16s rDNA 염기서열정 보를 NCBI의 GenBank에 등록하였다. 또한 8종의 인삼종자내 생균에서 분석된 염기서열정보를 이용하여 미생물들 간의 유 연관계를 분석하였다 (Fig. 2). 그 결과 분자적 유연관계에서 는 2개의 clade가 형성되었다.

특히 clade A를 형성하는 PgSEB5-37A, PgSEB5-37B, PgSEB5-37D, PgSEB5-37E, PgSEB5-37F, PgSEB5-37G, PgSEB5-37H는 매우 근접한 유연관계를 형성하고 있었으며 PgSEB5-37C는 단일 clade를 형성하였다. 이러한 결과로 미루 어 볼 때, clade A에 속하는 내생균들과 clade B에 속하는 PgSEB5-37C는 생물학적 특성에 차이가 있을 것으로 사료된다.

각각의 인삼종자내생균이 미생물비료로써 활용가능성을 탐 색하기 위해 생물방제활성과 생물비료활성을 조사하였다. 인 삼종자 내생균주를 접종하지 않고 병원균을 배양하여 대조군 으로 사용하였으며 내생균주를 접종한 배지와 비교한 결과, PgSEB5-37E이 Cylindorocarpon destructans에 대해 3mm 이 상의 균사생장 저지원을 형성하였으며 Botrytis cinerea과 Fusarium solani에 대해서는 1.45mm의 저지원이 형성되었다. 그러나 Rhizoctonia solani에 대해서는 항균활성 효과가 나타 나지 않았다 (Fig. 3).

PgSEB5-37E는 Pseudomonas aeruginosa으로 추정되며, 이 속의 미생물은 항진균활성 물질을 내어 여러 식물의 병을 억 제한다고 밝혀져 있다. 이러한 이유로 Pseudomonas 속 미생 물은 생물학적 방제에 널리 사용되는 세균이라는 보고가 있다 (Di Battista-Leboeuf et al., 2003; Rye et al., 2000). 위 실 험에서 PgSEB5-37E는 인삼병원균에 대한 항균활성 효과가 확 인되었기 때문에 인삼포장 적용을 통해서도 병증억제에 대한 효과가 있을 것으로 사료된다.

미생물이 생성하는 siderophore는 토양에 유리되어 있는 철 이온과 선택적으로 결합하여 식물병원균보다 우선적으로 철 이온을 흡수하여 식물병원균의 생육을 저해시켜 생물학적 방 제효과가 있는 것과 동시에 식물이 이용할 수 없었던 철을 가 용시켜 식물 성장에 도움이 되는 것으로 알려져 있다 (Arora et al., 2001). 종자내생균의 siderophore 생산성을 조사한 결과, PgSEB5-37D, PgSEB5-37F, PgSEB5-37G는 siderophore의 생산성이 없었고, PgSEB5-37A, PgSEB5-37B, PgSEB5-37C, PgSEB5-37E, PgSEB5-37H에서는 생산성을 확인할 수 있었다 (Fig. 4).

PgSEB5-37E 균주를 배양시킨 CAS-blue agar 배지의 orange halo zone의 비율이 더 크므로 다른 균주들에 비해 siderophore를 더 많이 생성한 것으로 보인다. 그러나 이는 정 성적 연구결과이므로 추후에 정량적 실험을 통해 정확한 분석 이 필요할 것으로 사료된다.

인삼종자내생균의 다양한 생리활성 유무는 Table 2에서 보 는 바와 같으며, PgSEB5-37B와 PgSEB5-37H 두 균주가 미 량의 IAA를 생성하는 것으로 확인되었다.

IAA는 대표적인 생물생장촉진 호르몬으로, 식물에서 줄기신 장생장, 뿌리형성, 과실생장, 세포분열 등을 촉진시켜 식물이 생장하는데 도움을 주며, 정아우세, 굴성와 같은 다양한 생리 학적 과정을 제어하는 역할이 있어 식물에서 아주 중요하다 (Pandey et al., 2005). 식물은 식물내부에서 합성되는 IAA에 영향을 받을 뿐만 아니라 외부에서 공급되는 IAA에 생리적인 활성을 나타낸다 (Thimann, 1937).

또 PgSEB5-37B, PgSEB5-37E, PgSEB5-37F, PgSEB5- 37G, PgSEB5-37H는 질소원이 없는 배지에서 자라는 것으로 보아 질소고정능력이 확인되었다 (Fig. 5).

한편, 인삼종자 내생균들의 불용성 인산 가용화 능력을 조사 한 결과 PgSEB5-37D, PgSEB5-37E, PgSEB5-37H가 NBRIP agar 배지에서 콜로니 주위에 투명대를 형성하였다 (Fig. 6).

인은 식물 생장과 발달에 중요한 영양분 중 하나이다. 이것 은 토양에서 식물이 흡수 할 수 없는 불용성 형태의 인산염을 미생물이 가용화 시킴으로써 합성인산비료의 사용을 경감시킬 수 있으며, 지력의 감소 없이 작물의 생산성을 향상 시킬 수 있다. 그러므로 본 연구에서 분리동정된 인삼종자내생균인 PgSEB5-37D, PgSEB5-37E, PgSEB5-37H가 식물생장을 촉진 시키는데 도움을 줄 것으로 사료된다. 종합적으로 살펴보면 PgSEB5-37C를 제외한 나머지 인삼종자 내생균들이 생물방제 및 비료활성에 가능성을 보였다. 이 결과는 앞서 조사한 분자 적 유연관계를 통해서도 PgSEB5-37C를 제외한 나머지가 하 나의 clade를 형성하는 것에서부터 그들이 비슷한 역할을 할 것이라는 추정이 가능하다.

본 연구는 인삼종자내생균의 생물비료활용가능성을 평가하 기 위해 개갑 처리된 인삼 종자로부터 내생균을 분리하여 미 생물 군집의 다양성을 조사하였고, 생물방제활성과 생물비료 활성을 조사하여 생물비료 효용가치를 확인하였다.

최근 인삼재배에 따른 농약사용 및 비료시비에 관한 문제점 이 대두되고 있지만 이를 해결할 수 있는 방안은 제시되고 있 지 않다. 선행연구자들에 의해 보고된 바에 의하면 친환경비 료 및 병방제제로써 미생물을 이용한 기술이 효과적이라는 보 고 (Sa and Chauhan, 2009)가 있지만 인삼에서 연구된 사례 는 자연발효식품에서 분리한 Bacillus 균을 이용해 점무늬탄저 병 방제용 길항미생물을 선발하기 위한 연구 (Lee et al., 2012) 이외에는 없었다. 특히 인삼 내생균에 대한 연구는 매 우 미흡한 실정이며, 인삼종자로부터 분리된 내생균에 대한 연 구는 없었다. 이번 실험결과에서 발굴된 PgSEB5-37E가 항균 활성과 siderophore 생성에 양성결과를 보여 생물방제활성에 이용가능성이 높은 것으로 사료되며, PgSEB5-37B와 PgSEB5- 37H가 모든 생물비료활성에 양성을 보여 생물비료로 이용가 능성이 높다고 판단된다. 따라서 추후 각 실험에 대해 더 깊 이 연구하여 정량분석, 포장적용실험 등이 필요하다. 본 실험 을 통하여 선발된 인삼종자내생균을 이용해 추후 생물방제 및 비료로 활용될 수 있을 것이라 사료된다. 특히, 인삼은 1년생 부터 4년생까지는 생육이 왕성하게 증가하나 4년생 이후 6년 생까지 생육이 완만하게 증가하는데 (Park et al., 2013), 생장 촉진능을 가진 인삼 내생균을 활용한다면 생육이 완만해지는 4년 이후에도 지속적인 생장을 유지하여 고품질 인삼을 생산 하는데 이용할 수도 있을 것으로 보인다.